Quiero colaborar

TERAPIA GÉNICA

Un proyecto único que tiene como base la introducción de una copia sana de un gen defectuoso en las células del paciente

PLAN DE TRABAJO

La metodología y/o plan de trabajo que se lleva a cabo en Terapias Génicas consiste en:

1. Profundizar en los mecanismos de dinámica mitocondrial, mitofagia y autofagia asociados a TBK1 en modelos in vitro deficientes en TBK1.

Con el propósito de estudiar en profundidad el papel de TBK1, se generará una línea con silenciamiento estable en este gen. Se estudiará el efecto del silenciamiento de TBK1 sobre la viabilidad celular. Para ello se realizará un ensayo de viabilidad celular (MTT) utilizando las células SH-SY5Y silenciadas para TBK1 y las formas con la re-expresión de las formas mutantes de EP en comparación con las células en las que se re-expresará la forma WT. Dado que TBK1 interviene en los procesos de autofagia y también más concretamente, en la autofagia selectiva de mitocondrias (mitofagia), se estudiará el papel de TBK1 en estos procesos. Se analizarán los niveles de los principales marcadores de autofagia, p62 y p62 fosforilada y LC3-II, mediante Western blot, ya que TBK1 interviene fosforilando p62 en serina 403, facilitando el flujo autofágico.

Se estudiará la viabilidad celular, y los procesos de dinámica mitocondrial, mitofagia y autofagia anteriormente analizados en los modelos celulares generados en fibroblastos de pacientes con EP portadores de las mutaciones en TBK1 causantes de la enfermedad Se analizarán los niveles proteicos de TBK1, la viabilidad celular, la expresión de marcadores de dinámica mitocondrial, mitofagia y autofagia, en los fibroblastos procedentes de los pacientes portadores de mutaciones en TBK1 y sujetos sanos controles.

2. Desarrollar un modelo in vivo deficiente en TBK1 que desarrolle la patología de EP.

Los resultados obtenidos previamente en los objetivos anteriores serán validados en un modelo experimental in vivo para establecer estudios directos de causa-efecto con el análisis posterior de las vías específicas implicadas. Se generará un modelo inducible de bloqueo de la expresión de TBK1 mediante el sistema CRISPR/Cas9 y se utilizará un sistema de infección con lentivirus directamente a nivel de la substancia nigra. En este modelo experimental se analizarán los niveles proteicos de TBK1, la expresión de marcadores de dinámica mitocondrial, mitofagia y autofagia, así como mecanismos neuropatológicos de la EP relacionados con la acumulación de depósitos de alfa-sinucleína, procesos de estrés oxidativo, neuroinflamación (marcadores gliales y niveles de citoquinas pro-inflamatorias), marcadores dendríticos y de neurodegeneración y muerte celular. Estos estudios serán llevados a cabo mediante ensayos bioquímicos, incluyendo Western blot y PCR, e inmunohistoquímicos. También se evaluarán posibles efectos sobre el comportamiento de los animales y su capacidad locomotora y de memoria utilizando una batería de tests de comportamiento según protocolos habituales.

3. Investigar posibles alternativas terapéuticas en los modelos in vitro e in vivo deficientes en TBK1 centradas en la modulación de la función autofágica.

Se estudiarán los posibles efectos protectores de la proteína lactoferrina utilizando los modelos in vitro deficientes de TBK1 descritos en el objetivo 1. Las células SH-SY5Y silenciadas para TBK1 y con re-expresión de TBK1 y los fibroblastos humanos con mutaciones en TBK1 serán tratados con lactoferrina y se analizará la viabilidad celular, la expresión de marcadores de dinámica mitocondrial, mitofagia y autofagia. Se investigarán los posibles efectos protectores de la proteína lactoferrina utilizando los modelos in vivo deficientes de TBK1 descritos en el objetivo 2. Se administrará la lactoferrina por vía intranasal 3 veces por semana durante 2 semanas, en base a estudios previos. Al finalizar el período de tratamiento se analizarán tanto la expresión de marcadores de dinámica mitocondrial, mitofagia y autofagia, así como mecanismos neuropatológicos de la EP, incluyendo la acumulación de depósitos de alfa-sinucleína, procesos de estrés oxidativo, neuroinflamación, neurodegeneración y muerte celular. Estos estudios serán llevados a cabo mediante ensayos bioquímicos, incluyendo Western blot y PCR, e inmunohistoquímicos. También se evaluarán posibles efectos beneficiosos sobre el comportamiento de los animales y su capacidad locomotora y de memoria utilizando una batería de test de comportamiento.